一、导言

2013年4月，在佛罗里达州奥兰多举行的PDA年会上首次公开描述了低内毒素回收率（LER）^[1]，但多年来，制药科学家一直在观察这一现象，主要是在样品鉴定测试过程中发现的典型“抑制”现象。

美国食品药品管理局（FDA）于2012年发布了《行业热原和内毒素检测指南：问答》^[2]。FDA在该指南中提出的第三个问题涉及确定产品中内毒素的稳定性。FDA对这一问题的答复是“检测内毒素的能力会受到储存和处理的影响。企业应利用证明可检测内毒素含量稳定性的实验室数据，制定用于细菌内毒素分析的样品储存和处理（包括产品混合）程序。规程应考虑到研究中使用的内毒素来源，同时牢记纯化的内毒素可能会与天然来源的内毒素产生不同的反应"。

二、天然内毒素和纯化脂多糖

纯化的脂多糖和天然内毒素不是同一种物质。脂多糖、天然内毒素和低内毒素回收率（也称为内毒素掩蔽）的简要描述如下：

脂多糖（LPS）是内毒素分子中具有生物活性的成分。众所周知，从大肠杆菌O113:H10中提取的高度纯化LPS是从美国药典（USP）获得的一级标准（内毒素参考标准品或RSE）和从裂解物供应商处获得的二级标准（内毒素控制标准品或CSE），用于标准化鲎变形细胞裂解物（LAL）试剂并执行药典适用性测试的药典细菌内毒素测试（BET）。

纯化的LPS并非真正的内毒素，而是革兰氏阴性细菌细胞壁片段的一部分。相反，天然内毒素是革兰氏阴性细菌细胞外壁的组成部分。它们以囊泡形式自然存在，其中含有LPS、外膜表面蛋白、脂蛋白和磷脂。天然内毒素以细菌细胞壁碎片的形式存在，是一种极其稳定的高分子量分子，耐高温和耐化学破坏。

LER也被称为内毒素掩蔽现象。LER是指在一项旨在证明可测定内毒素稳定性的研究中，无法回收加标量的LPS。当在制备用于测试的样品基质稀释液之前将LPS直接添加到样品中时，就会发生掩蔽。LPS会消失，并且在检测时无法恢复。

行业研究表明，天然内毒素不表现出LER效应。相反，研究表明 LPS确实表现出LER效应，尤其是当直接放入含有阳离子螯合柠檬酸盐和磷酸盐缓冲系统以及聚山梨醇酯表面活性剂的生物单克隆基质中时。因此，正如裂解物专家JamesCooper博士所指出的那样，这种现象实际上是低脂多糖回收率（LLR），而不是LER（低内毒素回收率）^[3]。确定本文所示实验是否证明LLR的标准是分析物起始浓度的回收率<50%。

三、行业回应
业内对于FDA对解决内毒素稳定性（尤其是生物制品内毒素稳定性）的要求存在一些困惑。最初的解释是，如果发现产品没有“可检测内毒素”，检测实验室就没有充分的理由证明“可检测内毒素的稳定性”。毕竟，零时不存在分析物（内毒素），因此不存在稳定性问题。由于故意用纯化的LPS（如CSE或RSE）污染产品似乎不是一种可行的实验设计，因此许多制药公司开始着手创建标准化的天然内毒素来加标产品。2014年5月在费城举行的细菌内毒素峰会上，一位FDA审查微⽣物学家在公开论坛上被问及一个澄清问题。根据他的回答，我们相信FDA对第三个问题回答的初衷并不是人为地用内毒素污染样品来证明可检测内毒素的稳定性。

回想起来，在了解标签上关于储存重组CSE和RSE的说明的情况下，用LPS进行加标实验似乎并不明智。在重组形式中，RSE建议的保存时间为在2-8°C下保存14天。CSE在重组形式下具有更长的标示保质期（大多数供应商建议），在2-8°C为30天。大多数微生物学家都很保守，每天结束时都会丢弃稀释的RSE或CSE标准品。

此外，RSE和CSE在螯合缓冲液中会随着时间的推移而消失，这对大多数按照USP<85>细菌内毒素测试要求进行内毒素测定的微生物学家来说并不奇怪。抑制和增强测试已经证明，许多产品基质无法在未稀释的情况下进行测试。

对于进行LER实验的公司来说，证明RSE和CSE添加到产品中的稳定性是不合适的。目前的证据表明，在某些生物基质或用于含有聚山梨醇酯和螯合缓冲液的单克隆抗体平台缓冲系统中，LPS活性会迅速丧失。最明显的是，产品蛋白不必存在即可测量CSE或RSE的损失。实际上，LER在制备大量生物产品的过程中立即发生，即在将聚山梨醇酯添加到柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液和纯化的蛋白质中时。可能的纠正措施（例如不延迟实验室测试或向下调整内毒素限值以适应回收损失）不是可行的解决方案。在许多情况下，“内毒素掩蔽”接近于100%的加标LPS的损失。

这些结果是否表明我们使用纯化的LPS作为CSE和RSE不适合作为标准品？绝对不是。早在20世纪70年代初期，一批早期的RSE就已根据家兔热原试验测试进行了标准化^[4]。裂解液制造商分发的CSE符合BET的二级标准，并根据一级RSE进行校准。RSE供应有限，是一种非常宝贵的资源，不能用于常规内毒素检测。标准的目的是量化产品中的内毒素含量，根据既定的验收标准评估测试值，并进行适用性测试。多年来，BET和这些标准为业界提供了极好的服务，因为患者发生热原反应的情况极为罕见。

目前没有证据表明当前药典中的BET会对患者安全造成影响。有充分证据表明，BET是一种比兔子热原测试更灵敏、更可靠的致热原预测方法^[4,5]。在药典BET的开发和标准化过程中，没有出现假阴性测试。在每种情况下，BET都能够检测并测量兔子无法检测到的内毒素热原。

在BET样品鉴定期间进行的适用性测试是通过将已知量的CSE或RSE“加标”到适当稀释的样品基质中来执行的，以证明内毒素检测机制（凝胶凝块、浊度形成或颜色形成）没有受到抑制或增强。对于某些产品，无需稀释。

然而，对于大多数产品，稀释是克服测试干扰的必要条件。凝胶凝块测定的有效性是在2λ阳性产品对照中的凝胶化。定量检测的有效回收率为阳性产品对照的50-200%。适用性测试的目的并非旨在直接从样品中鉴定内毒素的回收率，而是在稀释到无干扰和可测定的范围后进行鉴定。大多数药典生物测试资格都以这种方式验证样品的适用性。例如，在进行药典无菌测试的适用性测试时，通常将生物体添加到最终冲洗液中，而不是直接添加到测试样品中。

需要强调的是，当RSE或CSE不经稀释直接放入测试样品基质中时，就会产生LLR。关于“掩蔽效应“机制的细节还没有很好的描述。目前，生物基质中的“掩蔽“仅限于含有聚山梨醇酯表面活性剂的具有螯合特性的柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液。迄今为⽌，由于其在药物研发过程中的突出地位而评估的产品⼤多是单克隆抗体制剂。

LLR的一个假设是纯化的LPS可能不再被因子C的LPS结合受体识别。因此，没有活化的因子C可以触发导致凝胶凝固的酶级联反应^[7]。Petsch等人提出了另一种可能的解释，并提供了一些支持数据^[3,6,8]。提出的机制是，螯合缓冲剂可去除LPS分子中的二价阳离子，尤其是Mg⁺²，从而破坏胶束的稳定性，使其解离成对LAL反应较弱、单体和无法识别的形式。柏林内毒素研讨会的演示⽂稿中可以看到此事件的图解或卡通^[7]。许多产品配方在作为人工污染分析物直接放入产品基质中时，可能无法回收LPS。众所周知，许多干扰基质的pH值或低或高、螯合缓冲液或其他干扰因素都会导致LPS分子在BET中失去活性。

使用纯化的LPS来证明“可检测内毒素的稳定性“是一种不明智的策略。应使用天然内毒素进行证明。有些产品（包括疫苗）含有内源性内毒素，这些内毒素要么是其活性成分的一部分，要么是来自原材料或⼯艺的污染物。这些产品⼤多属于⽣物类别。证明“可检测内毒素的稳定性”可能很有价值，以确保成品在保质期结束时符合与 BET 放⾏产品相同的内毒素限值。然⽽，本文作者质疑在不存在内毒素的情况下，⼈⼯污染不含内毒素的产品以证明“可检测内毒素的稳定性”的价值。

四、LER的实验证据

进行了以下实验以证明在含有聚山梨醇酯的螯合缓冲液中的存在下，LER不存在，而LLR存在。实验采用了动态浊度法。CSE（LPS）在时间=0时新鲜制备。天然内毒素（来源于革兰氏阴性菌阴沟肠杆菌，浓度约为1000EU/mL）由裂解液供应商提供。用于测量的标准曲线值为5.0、2.0、0.5、0.125和0.05EU/mL（λ）。所有样品和测试稀释液均在无热原的玻璃试管中制备。除非另有说明，否则样品在测试间隔期间保持在2-8°C。所有结果均以EU/mL（IU/mL）为单位报告。

初步实验包括将CSE（LPS）和天然内毒素加入一系列单克隆抗体缓冲液基质中，并观察15天内BET测得的LPS和内毒素浓度的变化。

（一）实验一

第一个实验使用10mM磷酸钠缓冲溶液进行，并添加0.01%和0.02%的聚山梨醇酯80。还添加了无热原水对照（PFW）并进行了测试。为了确认此缓冲液的适用性测试，在PFW中制备了1:10的溶液稀释液，因为此稀释液之前已被证明是有效的常规测试稀释液。在未经稀释的溶液（10mL用于CSE[LPS]和5m内毒素缓冲液中添加200mcL CSE（LPS）和100mcL的内毒素，浓度约为1000EU/mL。CSE（LPS）和内毒素的预期浓度约为20EU/mL。结果表明，含有聚山梨醇酯80的磷酸钠缓冲液的CSE（LPS）反应性确实随着时间的推移而降低（图1）。而添加了天然内毒素的缓冲液的反应性并没有随着时间的推移而降低（图2）。

（二）实验二

第二项实验采用了两种类似的单克隆抗体（mAb）制剂进行，浓度为25mg/mL蛋白质，溶于20mM柠檬酸盐缓冲液。缓冲液中还含有150mM盐水和0.025%（V/V）聚山梨醇酯80。为了确认这两种单克隆抗体的适用性测试，用PFW配制了1:10的mAb稀释液，因为该稀释液以前一直是有效的常规测试稀释液。在未稀释的单克隆抗体溶液（CSE[LPS]为10mL，内毒素为10mL）中添加75mcL的CSE（LPS）和约1000EU/mL的内毒素。计算得出的CSE（LPS）和内毒素浓度约为7.5EU/mL。结果表明，CSE（LPS）受柠檬酸盐缓冲液和聚山梨醇酯80的影响很大，而真正的内毒素回收率则不受影响（图3）。其他研究（未显⽰）也表明，CSE（LPS）回收率的“掩蔽”效应⼏乎在加⼊未稀释的产品基质后⽴即开始。为了扭转“掩蔽“现象，研究人员使用了内毒素分散试剂和二价阳离子替代品，但收效甚微。

在含有聚山梨醇酯的柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液中，mAb的CSE（LPS）反应性会在6小时内丧失。在2-8°C、室温和30-35°C下重复实验4小时，反应性的丧失似乎与温度有关。数据表明，掩蔽现象在较高温度下发生得更快（图4）。在将CSE（LPS）污染物添加到未稀释的基质中之前，添加了内毒素分散试剂，进行了一项具有启发性的额外实验。结果表明，在这些条件下，掩蔽效应不会发生。然而，向已被掩蔽的CSE（LPS）中添加内毒素分散试剂也不能逆转LLR效应，即使在30-35°C下保存过夜也是如此（数据未显示）。

五、其他平台缓冲系统

另一种常见的生物基质缓冲液是组氨酸缓冲液，它不具有柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液的螯合作用。在组氨酸缓冲液中对mAb进行了一项实验，该缓冲液经过冻干和重构以供测试。重构的样品基质为10mM组氨酸缓冲液中的25mg/mL蛋白质，其中含有7%蔗糖和0.02%聚山梨醇酯80。在未稀释的单克隆抗体溶液（CSE[LPS]10mL，内毒素10mL）中分别添加200mcL和75mcL的CSE（LPS）和内毒素，浓度约为1000EU/mL。CSE（LPS）和内毒素的预期浓度分别约为20EU/mL和7.5EU/mL。20EU/mL的加标样品按1:50稀释后进行检测（常规检测稀释），7.5EU/mL的加标样品按1:10稀释后进行检测（产品的最大有效浓度）。还添加了PFW对照（数据未显示）。

该基质表明CSE（LPS）和天然内毒素均不受影响，并且在15天的测试时间内回收率都很稳定（图5）。

六、总结与结论

数据表明，纯化的LPS和天然内毒素在不同生物制剂的添加和恢复实验中反应不同。天然内毒素而非纯化的LPS是内毒素稳定性的可靠预测指标，尤其是在含有聚山梨醇酯表面活性剂的螯合柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液存在的情况下。LPS“掩蔽”效应的确切机制尚不清楚，但据其他研究人员报告，这可能是胶束不稳定的结果。

本文所报告的实验室研究清楚地表明，低内毒素回收率现象是研究设计和样本基质的产物。低内毒素回收率（LER）并不是一种真实的现象，因为天然内毒素并没有被掩盖。作者支持库珀（J.Cooper）提出的观点，即这种产物应称为低脂多糖回收率（LLR）。药典规定的BET仍然是测量细菌内毒素的一种高度灵敏、准确且可靠的检测方法。尽管最近LLR现象备受关注，但注射用药物和生物制品仍然是安全的。

参考文献

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2.Guidance for Industry Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers, U.S. Food and Drug Administration. June 2012.

3.Cooper J. “How Can Water Interfere with the BET Test.” Presented at PMF Bacterial Endotoxin Summit. Philadelphia, PA, USA. May 15-16, 2014.

4.Williams KL. Endotoxins as a Standard. In: Endotoxins: Pyrogens, LAL Testing and Depyrogenation. Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Volume 111. 2nd ed. Marcel Dekker Inc. New York, USA. 2001: 136-164.

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October 2013; XLIX (9):14, 16.

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9.Reich J. “Reliability of Endotoxin Detection Mechanical principles of Endotoxin masking and Strategies for Demasking.” Presented at the 2014 Preconference Workshop on bacterial Endotoxin Testing. Berlin, Germany, February 2014.