在医疗产品的质量保证过程中，无菌检验是必不可少的。对于肠外药品来说，避免出现发热原至关重要。这些致热物质（内毒素和非内毒素）在标准灭菌过程中无法消除，一旦进入血液就会产生生物活性，对人体健康造成危害，轻则引起轻微反应（如发烧），重则导致脓毒性休克和死亡。因此，对注射制剂开展热原检测是必不可少的流程。

一、热原测试方法的演进

自20世纪以来，热原测试方法不断发展。20世纪40年代，家兔热原检测（Rabbit Pyrogen Test，RPT）作为基于发热反应终点的体内检测方式出现。该方法通过向兔子耳静脉注入试验物质，监测其直肠体温变化来判断是否存在热原污染。

然而，RPT方法存在诸多局限性。它容易受到兔子饲养条件、种类差异等因素的干扰，无法检测特定物质，而且在医疗器械植入时容易出现局部反应。此外，动物试验结果不能直接应用于人体，但由于其能检测未定性热原，至今仍被视为热原检测的“黄金标准”。不过，这一方法在欧洲每年用于肠外药物试验的兔子超过10,000只，给动物带来了极大的压力。

二、寻求替代：从3R战略到新方法的探索

鉴于RPT方法的局限性，自1986年起，欧洲药典委员会积极实施3R战略，致力于开发替代方法。经过多年努力，2021年欧洲药典委员会决定在五年内用先进的体外检测（如MAT）完全取代RPT。2024年6月，该委员会正式批准从所有条款中删除家兔检测，修订文本将于2025年7月1日生效。

*网址来源：https://www.edqm.eu/en/-/ph.-eur.-bids-adieu-to-rabbit-pyrogen-test-in-its-monographs

在RPT方法逐步被取代的过程中，鲎变形细胞裂解物（Limulus Amebocyte Lysate，LAL）检测法成为热原检测的重要替代方法。该方法利用鲎血变形细胞提取物通过凝血技术检测内毒素，灵敏度高达0.005EU/ml，远高于兔热原试验（0.5-3EU/ml）。随着不断改进，从凝胶凝块检测法发展到浊度测定法和显色鲎试剂检测法，灵敏度可达0.001EU/ml。

但LAL检测法也存在不少问题。它易受多种无害物质影响而出现假阳性，只能检测细菌内毒素，无法检测非内毒素致热原或其他污染物的增效作用，而且获取鲎血淋巴会对马蹄蟹种群产生影响。因此，人们仍在不断寻找更为理想的热原检测方法。

三、新型检测方法：重组试剂与单核细胞活化试验

2024年11月，《美国药典-国家处方集》（USP-NF）正式纳入了第86章“使用重组试剂的细菌内毒素测试”，并宣布该章节于2025年5月起正式生效。其中，PyroSmartNextGen®重组鲎试剂作为全球首款完整的重组级联试剂（rCR），完全模拟了天然鲎试剂LAL的酶联反应，剔除了容易引起假阳性的G因子，且不依赖鲎血，符合可持续发展的目标。

尽管LAL检测法在灵敏度等方面有所提升，但它更像是RPT的补充而非替代。因为其与哺乳动物的热原反应机制存在差异，只能评估液体样本中的细菌内毒素，使用的系统也与哺乳动物系统不同，可能无法反映样本的真实热原潜力，所以和RPT一样，LAL试验也不能完全预测人体对试验物质的反应。

随着对发热反应分子机制研究的深入，单核细胞活化试验（Monocyte-Activation Test，MAT）作为一种体外热原检测方法逐渐崭露头角。MAT利用人体全血与热原接触后产生的促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF）来评估热原污染，能模拟人体先天免疫系统反应。它不仅能检测各种热原污染物，包括未定性热原和非内毒素，还能检测塑料、金属、植入物和医疗器械等固体材料。

MAT于2010年和2012年分别被纳入《欧洲药典》和《美国药典》。该方法有多种变体，提供不同的人类单核细胞来源，如全血、分离的原始单核细胞（如PBMC）或单核细胞系。虽然相比rCR检测法，MAT存在供体变异导致灵敏度偏差和检测范围较窄的问题，但可以对热原进行定量，且使用全血及其成分更可能再现体内反应。

尽管新鲜全血的可获得性有限，但可以通过低温保存的血液或白细胞介素(PBMC)来解决。验证研究表明，全血含有对热原反应的必要成分，且热原刺激的分子机制已成功应用于体外模型中。

四、总结：综合选择，保障用药安全

在药品生产过程中，热原检测对于保证肠外药品、医疗器械、生物制剂等直接或间接进入血液物质的质量与安全意义重大。家兔热原试验（RPT）、鲎变形细胞裂解物（LAL）试验和单核细胞活化试验（MAT）各有优缺点，在实际应用中，需要根据具体情况合理选择检测方法，以最大程度保障患者用药安全。