◆什么是内毒素？

内毒素（endotoxin）是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。也被称为Lipopolysaccharide，统称LPS。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。

肠道杆菌多为革兰氏阴性杆菌，具有内毒素，若引起败血症、脑膜炎等感染时，可用血液、脑脊液及体液等检测内毒素，以协助临床诊断。另外，在生产药剂等过程中，自然环境中产生内毒素的细菌也常污染注射制剂、生物制品等，出厂前也要严格检查。内毒素的检测在现代临床生物技术中越发显得重要

内毒素是具有代表性的发热物质，pg (10-12g)和ng (10-9g)等即便只有微量，一旦进入血液中即会引起发热等各种症状。例如:

生物系统

细胞系统

分子系统

◆内毒素的生物活性和耐热性

内毒素非常耐热，使用高压灭菌器处理无法使革兰氏阴性菌完全失活。为使其完全失活，需在250℃以上干热灭菌30分钟。革兰氏阴性菌无处不在，菌体被消灭后仍会残留内毒素。

内毒素和巨噬细胞、树突状细胞的TLR4 (Toll-like receptor4)结合，借助NF-_kB作用于核上，产生各种细胞因子。通过细胞因子表现出各类生物活性。

如图三的结构图所示。脂质A是负责生物活性物质的主要部分，这部分的分子量约为两千。包含糖链整体的分子量一般为5000到8000左右。但是，因内毒素是一种同时拥有亲水部分（糖链）和疏水部分（脂质A）的分子，能在水溶液中相互缔合，形成外形是约有数十万到数百万分子量的胶束结构。有报告指出，胶束结构一旦发生变化，生物活性的强弱也随之变化。

图4所示为大肠杆菌和沙门氏菌脂质A的结构。从图中能看出即使菌株不一样，大部分脂质A的基本结构大部分仍然相同。

由马蹄蟹（美洲鲎）的阿米巴样细胞溶解物制备的试剂可用于检测细菌内毒素。如图3所示，在内毒素的参与下，级联反应开始进行，其中C因子，一种丝氨酸蛋白酶前体，最先被活化。随后接下来的是B因子的活化，B因子也是一种丝氨酸蛋白酶前体和凝固酶前体，它能将凝集原水解成凝集素，形成不溶性凝胶。

在LAL测试中，内毒素可以通过三种方式定量：

1. 对凝胶的形成进行测定
2. 对浊度的增加进行测定
3. 或对由合成底物分解而释放出的黄色色原体进行测定。

普通的LAL试剂不仅与内毒素反应，而且会与（1→3）-β-D-葡聚糖（真菌细胞壁成分）反应，因为G因子途径会在LAL试剂作用下被激活。为了消除这种（1→3）-β-D-葡聚糖活化，在工业中通过去除G因子或抑制其活化，开发了各种内毒素特异性试剂。

市场上有着各种基于图3中的反应机理所制得的LAL试剂以及检测体系。因此，根据所需的准确度、测试频率、样本数目以及其他相关因素来选择最合适的产品是十分重要的。

美国，欧洲和日本的药典中包含了三种内毒素检测方法，分别是凝胶法、显色法和浊度法。

(1) 凝胶法

　　将样本与LAL试剂在试管中混合，并使用干浴器，在37±1°C下，孵育60±2min，期间不要振动。加热完成后，立即缓慢地将试管倾斜180°。如果凝胶已形成并能保持其完整性而不变形或塌陷，则结果可确定为阳性，而如果未形成凝胶则为阴性。在检测期间，对于一系列样本，要进行多倍稀释（通常为2倍），以检查每个样品的结果是否为阳性。确定为阳性的最大有效稀释倍数或最小浓度被称为终点。

（2）显色法

　　由于内毒素会使LAL试剂活化，显色法是根据其对显色底物的分解来检测其活化。由于对硝基苯胺的黄色的吸光度是在405 nm波长下检测的，如果样品在约405 nm波长下具有相当大的光吸收，则不宜使用显色法。

（3）浊度法

　　浊度法利用凝胶浊度的变化来检测由内毒素诱导所产生的LAL试剂的活化。它不适用于具有一定浊度的样品。

3.对检测用具的要求

　　用于内毒素检测的所有检测用具必须不含内毒素和β-葡聚糖。为使内毒素失活，需要在250°C下干热处理超过30 min。建议使用经干热灭菌的玻璃器皿。避免使用金属工具，因为即使有少量被洗脱出的金属离子（例如铁，铝，镓，铬），也可能影响测试。而当使用一次性塑料工具（其制造商未能保证其能用于检测用途）时，检查它们是否满足以下要求（与玻璃器皿相比）：1）未被内毒素污染; 2）不吸附内毒素; 3）无洗脱物。

4.内毒素标准品

　　根据检测目的使用适当类型的内毒素标准品。

•需符合BET（美国药典/ 欧洲药典 / 日本药典）的检测，例如药品和医疗器械的产品最终检验

→必须使用美国药典，欧洲药典或日本药典标准的内毒素国家标准品。

•对材料，工艺流程和其他相关主题的检测

→可以使用内毒素工作标准品（CSE）。

5. 样本干扰

　　有时候需要采取预防措施，以防止样本对内毒素检测有潜在影响（反应干扰）。这些干扰分为以下两种类型：

（1）对LAL试剂的干扰

•蛋白变性剂（例如酸，碱，尿素，表面活性剂，有机溶剂）

•蛋白酶和蛋白酶抑制剂

•螯合剂（会清除反应所需的钙和镁）

•对于显色法：着色物质（在约405 nm处具有相当大吸收的物质）

•对于浊度法：浊度

（2）对内毒素的干扰

•金属离子（例如铁，铝，镓和铬离子。即使微摩尔级别的存在也会对测试产生影响）

•表面活性剂

　　样本的干扰效果可以通过进行药典中的干扰因子测试来衡量：即通过对加标了已知量的内毒素的样本进行检测，获得加标内毒素的回收率。如果回收率在50％至200％范围内，则可以确定该样本不会造成影响，换句话说，检测所得的内毒素浓度是正确的。如果发现样本会造成影响，可以通过对样本溶液进行稀释，从而减少对测试的影响。然而，对样本溶液的稀释会提高了由原始溶液（预稀释溶液）的浓度转换而得的内毒素浓度值。合理的稀释倍数（最大有效稀释倍数），是根据待检测的内毒素的所需浓度以及所用LAL试剂的检测灵敏度来确定的。欲了解反应干扰因子和最大有效稀释度的详细信息，详见药典中的细菌内毒素检测。

6. 内毒素特异性试剂

　　LAL试剂和内毒素的级联反应机制如图7所示。如果反应体系中存在（1→3）-β-D-葡聚糖*，会激活G因子，引起伴有凝胶化的假阳性反应。在这种情况下，无论体系中是否存在内毒素，都会发生反应，意味着无法对内毒素进行特异性检测。过量的β-葡聚糖可以抑制其自身反应的原理如图5所示：β-葡聚糖和LAL试剂之间反应的浓度范围对于整个反应而言很窄。另一方面，内毒素和鲎试剂的反应在很宽的浓度范围内都会发生，并且不受大量共存的β-葡聚糖的任何干扰。

7. 基因重组鲎试剂

基因重组鲎试剂

基因重组鲎试剂（PSNG）是一种基因工程技术合成的细菌内毒素定量检测试剂。它完全模拟了天然鲎试剂LAL的酶联反应，包含C因子、B因子、凝固酶原，且剔除了容易引起假阳性的G因子干扰。杜绝了由1,3-β-D-葡聚糖交叉反应造成的假阳性结果。

相比传统鲎试剂内毒素检测方法，基因重组鲎试剂可以产生级联放大反应，使得内毒素检测更加高效、灵敏，完成实验仅需10-30分钟，灵敏度高达0.0005EU/mL。

基因重组鲎试剂不依赖天然鲎血，既保护了鲎资源，又满足可持续发展的目标，其价值不言而喻。

基因重组鲎试剂不需要更换方法和设备，在现有的细菌内毒素检测方法（动态显色法）及设备上就能继续进行测试和分析。

PyrosKinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统

在PyrosKinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统及酶标仪上，基因重组鲎试剂的使用量仅需50μL，既节约试剂又降低了实验成本。

目前，基因重组鲎试剂已被纳入了USP、EP、JP药典法规。

未来，基因重组鲎试剂将在全世界医疗安全卫生中扮演不可或缺的角色。