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什么是内毒素?基因重组鲎试剂的特异性是什么?

  • 分类:行业新闻
  • 作者:
  • 来源:科德角国际
  • 发布时间:2022-03-14 17:31
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【概要描述】内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,叫做脂多糖。基因重组鲎试剂(PSNG)是一种基因工程技术合成的细菌内毒素定量检测试剂。它完全模拟了天然鲎试剂LAL的酶联反应,包含C因子、B因子、凝固酶原,且剔除了容易引起假阳性的G因子干扰。杜绝了由1,3-β-D-葡聚糖交叉反应造成的假阳性结果。

什么是内毒素?基因重组鲎试剂的特异性是什么?

【概要描述】内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,叫做脂多糖。基因重组鲎试剂(PSNG)是一种基因工程技术合成的细菌内毒素定量检测试剂。它完全模拟了天然鲎试剂LAL的酶联反应,包含C因子、B因子、凝固酶原,且剔除了容易引起假阳性的G因子干扰。杜绝了由1,3-β-D-葡聚糖交叉反应造成的假阳性结果。

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◆什么是内毒素?

内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,叫做脂多糖。也被称为Lipopolysaccharide,统称LPS。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来,所以叫做内毒素。

肠道杆菌多为革兰氏阴性杆菌,具有内毒素,若引起败血症、脑膜炎等感染时,可用血液、脑脊液及体液等检测内毒素,以协助临床诊断。另外,在生产药剂等过程中,自然环境中产生内毒素的细菌也常污染注射制剂、生物制品等,出厂前也要严格检查。内毒素的检测在现代临床生物技术中越发显得重要

内毒素是具有代表性的发热物质,pg (10-12g)和ng (10-9g)等即便只有微量,一旦进入血液中即会引起发热等各种症状。例如:

生物系统

●诱发内毒素休克

●发热性

●施瓦茨曼氏反应

●血液凝固

●白血球数量的减少或增加

●活性佐剂

●免疫增强作用

●免疫抑制作用

●抗肿瘤作用

●诱发耐药性

●皮质类固醇的释放

 

细胞系统

●巨噬细胞的活性化

●B细胞的活性化

●凝聚血小板

●粒细胞功能变化

●廿碳四烯酸代谢的活性化

●诱导基因表达

●各种细胞因子的产生

 

分子系统

●补体活性化

●接触因子活性化

●血浆酶原的活性化

●鲎反应

 

 

◆内毒素的生物活性和耐热性

内毒素非常耐热,使用高压灭菌器处理无法使革兰氏阴性菌完全失活。为使其完全失活,需在250℃以上干热灭菌30分钟。革兰氏阴性菌无处不在,菌体被消灭后仍会残留内毒素。

内毒素和巨噬细胞、树突状细胞的TLR4 (Toll-like receptor4)结合,借助NF-kB作用于核上,产生各种细胞因子。通过细胞因子表现出各类生物活性。

如图三的结构图所示。脂质A是负责生物活性物质的主要部分,这部分的分子量约为两千。包含糖链整体的分子量一般为5000到8000左右。但是,因内毒素是一种同时拥有亲水部分(糖链)和疏水部分(脂质A)的分子,能在水溶液中相互缔合,形成外形是约有数十万到数百万分子量的胶束结构。有报告指出,胶束结构一旦发生变化,生物活性的强弱也随之变化。

图4所示为大肠杆菌和沙门氏菌脂质A的结构。从图中能看出即使菌株不一样,大部分脂质A的基本结构大部分仍然相同。

由马蹄蟹(美洲鲎)的阿米巴样细胞溶解物制备的试剂可用于检测细菌内毒素。如图3所示,在内毒素的参与下,级联反应开始进行,其中C因子,一种丝氨酸蛋白酶前体,最先被活化。随后接下来的是B因子的活化,B因子也是一种丝氨酸蛋白酶前体和凝固酶前体,它能将凝集原水解成凝集素,形成不溶性凝胶。

在LAL测试中,内毒素可以通过三种方式定量:

  1. 对凝胶的形成进行测定
  2. 对浊度的增加进行测定
  3. 或对由合成底物分解而释放出的黄色色原体进行测定。

普通的LAL试剂不仅与内毒素反应,而且会与(1→3)-β-D-葡聚糖(真菌细胞壁成分)反应,因为G因子途径会在LAL试剂作用下被激活。为了消除这种(1→3)-β-D-葡聚糖活化,在工业中通过去除G因子或抑制其活化,开发了各种内毒素特异性试剂。

市场上有着各种基于图3中的反应机理所制得的LAL试剂以及检测体系。因此,根据所需的准确度、测试频率、样本数目以及其他相关因素来选择最合适的产品是十分重要的。

美国,欧洲和日本的药典中包含了三种内毒素检测方法,分别是凝胶法、显色法和浊度法。

(1) 凝胶法

  将样本与LAL试剂在试管中混合,并使用干浴器,在37±1°C下,孵育60±2min,期间不要振动。加热完成后,立即缓慢地将试管倾斜180°。如果凝胶已形成并能保持其完整性而不变形或塌陷,则结果可确定为阳性,而如果未形成凝胶则为阴性。在检测期间,对于一系列样本,要进行多倍稀释(通常为2倍),以检查每个样品的结果是否为阳性。确定为阳性的最大有效稀释倍数或最小浓度被称为终点。

(2)显色法

  由于内毒素会使LAL试剂活化,显色法是根据其对显色底物的分解来检测其活化。由于对硝基苯胺的黄色的吸光度是在405 nm波长下检测的,如果样品在约405 nm波长下具有相当大的光吸收,则不宜使用显色法。

(3)浊度法

  浊度法利用凝胶浊度的变化来检测由内毒素诱导所产生的LAL试剂的活化。它不适用于具有一定浊度的样品。

3.对检测用具的要求

  用于内毒素检测的所有检测用具必须不含内毒素和β-葡聚糖。为使内毒素失活,需要在250°C下干热处理超过30 min。建议使用经干热灭菌的玻璃器皿。避免使用金属工具,因为即使有少量被洗脱出的金属离子(例如铁,铝,镓,铬),也可能影响测试。而当使用一次性塑料工具(其制造商未能保证其能用于检测用途)时,检查它们是否满足以下要求(与玻璃器皿相比):1)未被内毒素污染; 2)不吸附内毒素; 3)无洗脱物。

4.内毒素标准品

  根据检测目的使用适当类型的内毒素标准品。

•需符合BET(美国药典/ 欧洲药典 / 日本药典)的检测,例如药品和医疗器械的产品最终检验

→必须使用美国药典,欧洲药典或日本药典标准的内毒素国家标准品。

•对材料,工艺流程和其他相关主题的检测

→可以使用内毒素工作标准品(CSE)。

5. 样本干扰

  有时候需要采取预防措施,以防止样本对内毒素检测有潜在影响(反应干扰)。这些干扰分为以下两种类型:

(1)对LAL试剂的干扰

•蛋白变性剂(例如酸,碱,尿素,表面活性剂,有机溶剂)

•蛋白酶和蛋白酶抑制剂

•螯合剂(会清除反应所需的钙和镁)

•对于显色法:着色物质(在约405 nm处具有相当大吸收的物质)

•对于浊度法:浊度

(2)对内毒素的干扰

•金属离子(例如铁,铝,镓和铬离子。即使微摩尔级别的存在也会对测试产生影响)

•表面活性剂

  样本的干扰效果可以通过进行药典中的干扰因子测试来衡量:即通过对加标了已知量的内毒素的样本进行检测,获得加标内毒素的回收率。如果回收率在50%至200%范围内,则可以确定该样本不会造成影响,换句话说,检测所得的内毒素浓度是正确的。如果发现样本会造成影响,可以通过对样本溶液进行稀释,从而减少对测试的影响。然而,对样本溶液的稀释会提高了由原始溶液(预稀释溶液)的浓度转换而得的内毒素浓度值。合理的稀释倍数(最大有效稀释倍数),是根据待检测的内毒素的所需浓度以及所用LAL试剂的检测灵敏度来确定的。欲了解反应干扰因子和最大有效稀释度的详细信息,详见药典中的细菌内毒素检测。

6. 内毒素特异性试剂

  LAL试剂和内毒素的级联反应机制如图7所示。如果反应体系中存在(1→3)-β-D-葡聚糖*,会激活G因子,引起伴有凝胶化的假阳性反应。在这种情况下,无论体系中是否存在内毒素,都会发生反应,意味着无法对内毒素进行特异性检测。过量的β-葡聚糖可以抑制其自身反应的原理如图5所示:β-葡聚糖和LAL试剂之间反应的浓度范围对于整个反应而言很窄。另一方面,内毒素和鲎试剂的反应在很宽的浓度范围内都会发生,并且不受大量共存的β-葡聚糖的任何干扰。

7. 基因重组鲎试剂

基因重组鲎试剂的出现有效解决了这些问题。

基因重组鲎试剂

基因重组鲎试剂(PSNG)是一种基因工程技术合成的细菌内毒素定量检测试剂。它完全模拟了天然鲎试剂LAL的酶联反应,包含C因子、B因子、凝固酶原,且剔除了容易引起假阳性的G因子干扰。杜绝了由1,3-β-D-葡聚糖交叉反应造成的假阳性结果。

基因重组鲎试剂(上图右侧)成功去除了

天然鲎试剂(上图左侧)的G因子干扰

相比传统鲎试剂内毒素检测方法,基因重组鲎试剂可以产生级联放大反应,使得内毒素检测更加高效、灵敏,完成实验仅需10-30分钟,灵敏度高达0.0005EU/mL。

基因重组鲎试剂不依赖天然鲎血,既保护了鲎资源,又满足可持续发展的目标,其价值不言而喻。

基因重组鲎试剂不需要更换方法和设备,在现有的细菌内毒素检测方法(动态显色法)及设备上就能继续进行测试和分析。

PyrosKinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统

在PyrosKinetix® Flex细菌内毒素定量检测系统及酶标仪上,基因重组鲎试剂的使用量仅需50μL,既节约试剂降低了实验成本

目前,基因重组鲎试剂已被纳入了USP、EP、JP药典法规。

未来,基因重组鲎试剂将在全世界医疗安全卫生中扮演不可或缺的角色。

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发布时间:2022-01-27 11:34:07

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