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影响鲎试剂灵敏度测定结果因素的分析

  • 分类:新闻资讯
  • 作者:张红霞 陈慧 马金刚
  • 来源:China Pharmacist
  • 发布时间:2022-07-01 09:44
  • 访问量:

【概要描述】本文对导致鲎试剂灵敏度测试结果误差的几个常见因素予以分析,为鲎试验提供参考。

影响鲎试剂灵敏度测定结果因素的分析

【概要描述】本文对导致鲎试剂灵敏度测试结果误差的几个常见因素予以分析,为鲎试验提供参考。

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试剂法是热原检查的重要经典方法与传统的家兔法相比具有灵敏度高重现性好成本低操作简便易于掌握等特点更便于基层检验推广使用如何用鲎试剂法替代家兔法检查热原也因此成为人们比较关心的问题[12]细菌内毒素检查法系利用试剂与细菌内毒素在一定条件下的反应结果来判断供试品是否符合规定的一种体外检测方法。鲎试验结果准确与否与所用试剂的灵敏度标示值相关性很大所以一定要严格执行试剂的质量标准尤其是试剂灵敏度的复核尤为重要[3]。鲎试剂灵敏度复核实验试验器具细菌内毒素标准品检查用水实验环境温度、鲎试剂自身特性等因素的影响与制约如果选择或操作不当势必会影响实验结果甚至导致实验失败本文对导致试剂灵敏度测试结果误差的几个常见因素予以分析试验提供参考

 

1、试剂自身质量不合格

试剂质量体现在灵敏度自凝时间与成胶状态三个方面

 

1.1灵敏度

试剂的标示灵敏度即在药典检查法规定的条件下使试剂产生凝集的内毒素的最低浓度[4]随存放时间试验条件的不同试剂在使用过程中的灵敏度也不尽相同存放一定时间后(如半年)质量稍差的试剂其灵敏度可能发生变化而灵敏度的改变会使测定结果所反映的供试品中内毒素的允许限值发生变化灵敏度偏低易产生“假阴性”灵敏度偏高易产生”假阳性”

 

1.2自凝时间

自凝时间指用无热原水或厂家所提供的内毒素检查用水将试剂溶解,(37±1℃放置后产生凝集所需的时间24h不凝集的为质量优者自凝时间不低于4h者为合格[5]因为质量较优的试剂本身不含内毒素或即使含有内毒素其量也较少不足以促发试验生化反应质量较差的试剂自凝时间短是因为试剂本身混有相当量的内毒素这种试剂是不能使用的

 

1.3成胶状态

成胶状态即试验反应终点时产生的凝胶状态质量优者反应前具良好的流动性反应后即形成坚实凝胶将成胶安瓿翻转180度而不会被破坏质量劣者反应终点时生成的凝胶不牢固易滑脱破坏有的甚至于反应终点时不能成胶

 

为防止因选择购买不当而引起的检验误差一方面购入时要选择质量较稳定的试剂要求必须具有国家颁发的批准文号一批新试剂应复核其灵敏度对留样试剂自生产之日起6个月进行一次灵敏度检测其灵敏度18个月内应符合规定[6]鲎试剂不应产生自身凝集作用应具有一定的缓冲能力与合适的pH我国现用的试剂为科动物东方的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品本品含能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原凝固蛋白原其灵敏度以细菌内毒素国家标准品或工作标准品测定应为标示量的50%~200%[4]另一方面要适量购买防止积压贮藏要避光严格控制温湿度避免防止因选购贮藏不当质量下降而引起的检验误差

 

2、细菌内毒素标准品本身效价不准确

试剂灵敏度检测中细菌内毒素标准品的效价亦是影响实验结果的重要因素因此选择合格的细菌内毒素标准品是必不可少的细菌内毒素的化学成分是脂多糖的复合体即脂多糖(LPS)是由O-特异性链-核心多糖-类脂A三部分组成其中类脂A的酰氨键是构成不稳定的重要因素之一故细菌内毒素标准品在运输或保管时易受气温影响而使效价衰减为避免试验结果的错判标准品的获得除应必须是由中国药品生物制品检定所统一发放外对标准品的效价复核亦为重要

 

细菌内毒素工作标准品

 

细菌内毒素标准品效价的测定方法如下:4支样品(待标)及一支国家标准品使用同一批号试剂每支样品按重量标准品按单位分别用内毒素检查用水稀释制备一系列2倍稀释度的内毒素溶液试剂反应4支样品的反应终点的对数平均值的标准差小于0.365计算4支样品反应终点的几何平均值(logC/ nng·ml-1表示)及标准品的反应终点值(EU·ml-1表示)按下式计算样品的效价:

 

3、细菌内毒素检查用水的质量标准低

细菌内毒素检查用水主要进行所用试剂的溶解以及细菌内毒素标准品稀释是实验过程中极为重要的一个环节细菌内毒素检查用水的质量标准低会直接影响试剂的检测结果细菌内毒素检查用水是一种特殊的水它不仅要求有严格的 pH6.8 ~8.2),而且其内毒素含量必须小于0.015EU·ml-1试剂在37±1℃条件下 24 h不产生凝集反应[4]它不同于注射用水不能用于代替使用如有些生产单位或医疗单位生产注射用水经过严格检查达不到现行版药典要求这类注射用水是不可以使用的因此我们现用的细菌内毒素检查用水主要由试剂生产厂家提供,质量较稳定

 

细菌内毒素检查用水

 

4、实验器具不洁净

玻璃试验管稀释管﹑刻度管铝盖盒等实验用具洗涤不彻底也会影响下次的检验结果使实验失败或造成误差因此每次检验完毕玻璃器皿应及时用铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液充分浸泡然后取出将洗液空干用自来水将残留洗液彻底洗净再用蒸馏水反复冲洗3遍以上控干后放入适宜的密闭容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内放置入烤箱250℃以上干热灭菌处理(待烤箱温度升至设定的温度后开始记时)[4]也可用其他适宜的方法,并确证不干扰细菌内毒素的检查试验操作过程应防止微生物的污染塑料橡胶等不耐热器材可用30%双氧水浸泡4h用无热原水冲洗70℃干燥备用

 

5、操作方法不当

选择合适的操作方法与顺序试剂灵敏度检测尤为重要在操作过程中以下几点值得注意

 

试剂溶解和配制时应尽量避免将安瓿外瓶壁脏物瓶壁碎片砂轮锯屑等异物混入试剂中避免试剂外损

 

试剂中含有多种蛋白质用力振摇会产生气泡一旦起泡难以消除既而影响检测的准确性所以在整个操作过程中都要避免因震动而引起的误差

 

③标准内毒素的配制和稀释时采用材质好而光洁的玻璃器皿作为内毒素稀释管,各稀释管吸取内毒素稀释液时要充分摇匀以稀释液洗吸管避免吸附内毒素

 

④反应物的量取和加样时标准内毒素液和样品液一定要加到试管底部接近试液而不接触试液的管壁处样品加入后立即轻轻摇匀

 

⑤活化物质的影响有的厂家生产的试剂中未加活化物质而加在溶解液中故最好以配套的溶解液来溶解试剂

 

pH的影响生成凝胶的最适pH6 ~8对于氯化钠注射液葡萄糖注射液(5%10%)等液体由于试剂本身的缓冲作用可以不考虑供试液的pH而检查其他制剂时应考虑供试品的pH尤其是一些本身缓冲能力较强或偏酸碱的供试品

 

6、操作温度与操作时间的影响

实验室温度和恒温水浴箱的温度都是不容忽视的因素37℃并不是最高反应温度反应温度越高反应速度越大即使在室温下操作内毒素和样品混合液不待进入37℃恒温反应器内反应已告开始这样操作误差较大操作温度较低试管外壁易结露同样会引起测定误差因此试验中要重视温度的变化同时应注意保温时间尤其夏天室温较高时加样在冰水浴中进行可取得较好效果

 

另外进行试剂灵敏度复核实验时实验室要求洁净无尘埃流通操作者应以严谨的科学态度严格执行操作规程以确保检测结果真实可信

 

参考文献

1潘东扬,汤秋华.灯盏细辛注射液细菌内毒素检查法的探讨[J],中国药师,200699:837-838

2薛瑾,刘浩,吕怀哲,等.注射用盐酸头孢吡肟细菌内毒素检查法[J].中国药师,200699:864-866

3中国药典[S].2005年版.二部.附录85-88

4中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规程[M].北京:中国医药科技出版社,2005. 287-297

5中国人民解放军医疗机构制剂规范[S].200年版.附录62-63

6中华人民共和国卫生部.部标准《鲎试剂》修订稿[S].WS1-364B-123)-91

( 2006-09-19收稿2006-12-13修回)

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发布时间:2022-01-27 11:34:07

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