从事细菌内毒素检测（BET）方法开发的分析人员经常会遇到新化合物或新产品，要求他们计算内毒素限值，为新材料开发检测方法，并将经过验证的检测方法转移到质量控制部门。什么是内毒素限值，化验开发人员需要了解哪些信息才能计算出内毒素限值？

内毒素是革兰氏阴性菌外细胞膜外层的成分。虽然内毒素注射到哺乳动物体内会产生多种生物效应，但目前 BET 检测的重点是确定材料中或材料上的内毒素含量是否足以导致患者发烧。由于革兰氏阴性菌在自然界中普遍存在，因此大多数原材料和肠外产品中可能都存在一定程度的内毒素。为了评估药品的安全性，药典BET根据产品特异性、剂量依赖性、给药途径依赖性和给药时间依赖性计算出的内毒素限值（Weary，1990）来测量常驻内毒素水平（Weary，1990）。

计算肠外药剂中内毒素限值的公式一般为K/M，其中 K =内毒素阈值剂量，M是药物剂量（单位/公斤/小时）。

K =内毒素阈值剂量

K是内毒素限值公式的分子，即内毒素阈值剂量（TPD）。这是一个常数，是对诱发兔子发烧所需的内毒素活性水平的统计评估。 （Wachtel and Tsuji，1976; Dabbah，等，1980）。根据这些研究结果，静脉注射（IV）或肌肉注射（IM）产品的内毒素阈值剂量为K= 5EU/（kg·h）。如果一种产品是鞘内给药（IT），也就是说该物质被注射到容纳脑脊液的空间中，K会降低到0.2EU/（kg·h）。如果药物产品是放射性药物，则非鞘内给药途径的K=175 EU，鞘内给药途径的K=14EU。

很多人，甚至一些现行的指导文件都混淆了这一点，认为“K”就是内毒素限值。然而，“K”只是故事的一部分……

M =ml /（kg·h）、mg /（kg·h）、U/（kg·h）

内毒素限值公式中的分母 "M "为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量， 供试品的剂量历来被解释为活性成分的剂量，除非产品是按体积/千克给药。如果目标患者群体是成年人，一般假定美国成年人的平均体重为70千克。然而，日本成年人的平均体重被假定为60千克。如果目标患者群体是一系列患者，则ml/（kg·h）通常是给目标组中最小患者的最大剂量。儿童的平均患者体重可以在疾病控制增长图表中心找到，https://www.cdc.gov/growthcharts/index.htm.如果ml/（kg·h）是某一药品的儿科剂量，则将其作为 M。如果产品是兽药产品并且可以施用于多种不同的动物，则ml/（kg·h）通常是给予最小动物的最高剂量。尽管这些是“经验法则”，但应通过计算代表目标患者群体极端情况的多个实例的ml /（kg·h）来确认它们。

由于放射性药物有半衰期，而剂量会随着药物失效而增加，因此放射性药物的M等于药物失效时的最大给药量。

计算内毒素限值

故事开始了。

产品开发组（PD）给化验开发实验室（AD）发了一封邮件，提前感谢他们为一个剂量为 50 mg的热门新产品计算内毒素限值。

1.AD假设成人肌肉注射的剂量为 50 mg/kg，其计算如下为：

K/M = 5 EU/（kg·h） ÷ 50 mg（kg·h） = 0.1 EU/mg.

2.AD组将此信息发送回PD组，PD组表示：“对不起。我们忘记告诉您剂量为50mg/人。”AD将此信息考虑在内，假设患者群体为成年人，并重新计算限值：

剂量/kg=剂量/人÷kg/人=50mg/人÷70kg/人=0.71mg/kg

K/M = 5 EU/（kg·h）÷ 0.71 mg/（kg·h） = 7.04 EU/mg.

3.“你难道不知道吗”，PD总监回电话说，“营销组已经采访了多位KOL，这些KOL正在寻找这种新热门药物的鞘内给药。请问AD能否重新计算一下内毒素限值？”AD假设鞘内给药的剂量为50mg/（kg·h），他们的新计算结果如下：

K/M = 0.2 EU/（kg·h）÷ 50 mg/（kg·h） = 0.004 EU/mg.

4.PD又发来另一封电子邮件：抱歉，第三点中的鞘内给药量不是50mg/kg，而是50mg/人，计算如下：

剂量/kg=剂量/人÷kg/人=50mg/人÷70kg/人=0.71mg/kg

K/M = 0.2 EU/（kg·h） ÷ 0.71 mg/（kg·h）  = 0.28 EU/mg.

5.哎呀。 KOL还希望在6小时内进行静脉输液。AD被再次要求计算内毒素限值，并假设总剂量为50mg/kg。但现在他们需要根据给药时间进行调整。

M = （总剂量/kg ÷（给药小时数）=（50 mg/kg）÷（6h）= 8.3 mg/（kg·h）

K/M = 5.0 EU（kg·h）÷ 8.3 mg（kg·h）= 0.6 EU/mg.

6.随后，AD接到日本营销集团的电话，该集团希望为成年人注射50毫克的全人体推注，也为平均体重20公斤的儿童注射35mg的全人体推注。

成人剂量/kg=剂量/人÷kg/人=50mg/人÷60kg/人=0.83mg/kg

K/M = 5 EU/（kg·h） ÷ 0.83 mg/（kg·h）= 6.02 EU/mg.

儿童剂量/kg=剂量/人÷kg/人=35mg/人÷20kg/人=1.75mg/kg

K/M = 5 EU/（kg·h）÷ 1.75 mg/（kg·h）= 2.86 EU/mg.

AD学到了什么？

1.永远不要假设。在开始计算之前，一定要获得所需的所有信息。计算内毒素限值需要三项重要信息：

• 给药途径。对于静脉注射（IV）或肌肉注射（IM）给药，K=5EU/kg，鞘内给药K=0.2 EU/kg。
• 每公斤患者的剂量。如果剂量是以“全人”剂量给予的，则必须用剂量除以目标人群的体重来调整剂量，来获得剂量/kg。如果相同的整体剂量适用于成人和儿童，则儿童剂量/（kg·h）将高于成人剂量/（kg·h）。
• 每小时剂量。 如果总剂量是通过持续“n”小时的输注给药，则必须通过将总剂量除以给药时间来调整，以获得每小时的剂量。

对于上述示例，AD针对初始请求计算了七种不同的内毒素限值，其中剂量为50mg

2.对于任何给药途径，内毒素限值都与剂量成反比。剂量越低，每单位剂量的限值就越高。试想一下 ：

• 如果剂量为1 mg/（kg·h），则内毒素限值为5 EU/（kg·h）÷1 mg/（kg·h）=5 EU/mg
• 如果剂量为10 mg/（kg·h），则内毒素限值为5 EU/（kg·h）÷10 mg/（kg·h）=0.5 EU/mg
• 如果剂量为100mg/（kg·h），内毒素限值为5 EU/（kg·h）÷100 mg/（kg·h）=0.05 EU/mg

3.一种产品的内毒素限值可能有很多种，这取决于PD小组的预测或最终包装说明书中关于剂量和给药的说明。要找到任何给定制剂的最低内毒素限值，必须将实验室提供的或包装说明书中描述的所有给药途径、剂量/kg和剂量/h结合起来进行计算。

最终，当产品总监询问这款热门产品的内毒素限值是多少时，AD必须说：“视情况而定。” 然而，如果第1点至第6点中描述的所有选项对于任何制剂都是可能的时候，则AD必须选择最低内毒素限值作为公司的内部放行规范，以便该药品可以用于所描述的任何给药方式中 例如，产品的内毒素限值为第3点时，计算结果为 0.004 EU/mg。

引用文献

1. Dabbah, R., E. Ferry Jr., D.A. Gunther, R. Hahn, P. Mazur, M. Neely, P. Nicholas, J.S> Pierce, J. Slade, S. Watson, M. Weary and R. L. Anford. 1980. Pyrogenicity of E. coli 055:B5 Endotoxin by the USP Rabbit Test – a HIMA Collaborative Study. J. Parent Drug Assoc. May-June

2. Wachtel, Ruth E. and Kiyoshi Tusji. 1977. Comparison of Limulus Amebocyte Lysates and Correlation with the United States Pharmacopeial Pyrogen Test. Appl Env Microbiol.33(6): 1265-1269.

3. Weary, Marlys. 1990. Understanding and Setting Endotoxin Limits. J Parent Sci Tech. 44(1): 16-18