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鲎试验检测内毒素的基本原理

鲎试验检测内毒素的基本原理

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  • 发布时间:2023-10-17 16:26
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【概要描述】细菌内毒素检查(鲎试验)取代热原检查是必然的趋势,应用鲎试验检查内毒素要比热原检查法更适应现代制药工业的发展。目前已有许多国家在药典中规定了细菌内毒素检查的品种。在我国也是如此,从1995年到2000年,《中国药典》规定的内毒素检测品种数量大大增加,并在方法学上也从单纯定性检查到定性检查和定量检查同时并存。不仅是对药品的检查,而且在临床医学诊断中,内毒素的检查也不可忽视,因此,内毒素的检测方法日趋多样化。目前,细菌内毒素检测方法不少于20种,但得到FDA批准使用的方法仅有四种。

鲎试验检测内毒素的基本原理

【概要描述】细菌内毒素检查(鲎试验)取代热原检查是必然的趋势,应用鲎试验检查内毒素要比热原检查法更适应现代制药工业的发展。目前已有许多国家在药典中规定了细菌内毒素检查的品种。在我国也是如此,从1995年到2000年,《中国药典》规定的内毒素检测品种数量大大增加,并在方法学上也从单纯定性检查到定性检查和定量检查同时并存。不仅是对药品的检查,而且在临床医学诊断中,内毒素的检查也不可忽视,因此,内毒素的检测方法日趋多样化。目前,细菌内毒素检测方法不少于20种,但得到FDA批准使用的方法仅有四种。

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细菌内毒素检查(鲎试验)取代热原检查是必然的趋势,应用鲎试验检查内毒素要比热原检查法更适应现代制药工业的发展。目前已有许多国家在药典中规定了细菌内毒素检查的品种。在我国也是如此,从1995年到2000年,《中国药典》规定的内毒素检测品种数量大大增加,并在方法学上也从单纯定性检查到定性检查和定量检查同时并存。不仅是对药品的检查,而且在临床医学诊断中,内毒素的检查也不可忽视,因此,内毒素的检测方法日趋多样化。目前,细菌内毒素检测方法不少于20种,但得到FDA批准使用的方法仅有四种。

鲎试验检测内毒素的基本原理

内毒素接触变形细胞后即可引起凝集反应,据此可以从鲎血变形细胞中提取其裂解物,制成鲎试剂。鲎试剂可测定患者血液中内毒素存在与否,可作为了解临床感染情况的一种检测方法。

鲎试剂与内毒素发生凝集反应的分子结构机制为:鲎血球的低渗抽取液中含有一种可凝固的蛋白(凝固蛋白原)及另一种高相对分子质量的凝固酶原。中国鲎凝固蛋白原的相对分子质量为16257(超速离心沉降平衡离心法测定为19300)的碱性单纯蛋白质,共由120个氨基酸组成。极微量的内毒素存在时,能激活凝固酶原使之变成凝固酶,并将凝固酶原上的Arg18-Thr19Arg46-Glyz47切断,游离出28个氨基酸残基所形成的肽链C,使凝固蛋白原的残余部分(肽链A与肽链B)通过双硫键的联合转化生成凝固蛋白,形成凝胶(图37-1)。

鲎试验检测内毒素的基本原理

基于上述原理目前可用下述几种方法对内毒素进行检测。

1、试管凝胶肉眼判断法简称试管法

试剂与被检样品混合后产生凝胶将试管倾斜用肉眼观察判断其凝结硬度此法简便但容易产生主观因素由于凝固点不易掌握因此不能进行定量分析。

2玻片微量呈色法简称玻片法

试剂与被检样品在玻片上反应形成凝胶﹐观察其凝固后加上色素更能清楚鉴别。它的优点是微量可节约试剂10倍左右。

3动态比浊法

动态比浊法即用光度计测定凝胶化过程中的浊度此法的敏感度较高但对照缺乏高度重复性。

4、荧光偏光法

现已不用于内毒素测定。

5、蛋白凝固法

蛋白凝固法即用中性缓冲液将凝胶洗净后将其不溶性蛋白用Lowry法定量。此法在定量方面敏感度﹑精确度良好但在血浆样品的检测时干扰作用问题尚待解决。

6、合成基质显色法

合成基质显色法系近年来开始应用的新方法它是以一种合成肽氨基酸为基质这种基质在分子结构上类似凝固蛋白原中的一段多肽分子Val-Leu-Gly-Arg),并在此多肽链上结合上一个对硝基苯胺paranitroanilinePNA),根据其显色程度可直接测定凝固酶活性因为凝固酶的激活强弱是根据内毒素的浓度而定。合成基质显色法的敏感度为试管法的10能精确定量试剂用量较少因此本法为目前最为优越的检测方法。

 

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