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鲎试验的测定操作简述(一)

鲎试验的测定操作简述(一)

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  • 发布时间:2023-10-19 16:03
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【概要描述】鲎试剂与内毒素作用形成凝胶后,用溴酚蓝染色,再压上盖玻片,形成呈色的“片状物”即为阳性。阳性反应呈“片状物”是由于高黏度颗粒的表面黏度系数增加所致;阴性则形成蓝色“环状圈”是由于反应产物的黏度低于阳性反应物,它的边缘是一种低黏度的溶液,由于粒度系数的降低而形成环状。

鲎试验的测定操作简述(一)

【概要描述】鲎试剂与内毒素作用形成凝胶后,用溴酚蓝染色,再压上盖玻片,形成呈色的“片状物”即为阳性。阳性反应呈“片状物”是由于高黏度颗粒的表面黏度系数增加所致;阴性则形成蓝色“环状圈”是由于反应产物的黏度低于阳性反应物,它的边缘是一种低黏度的溶液,由于粒度系数的降低而形成环状。

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1、试管凝胶肉眼判断法

将上述处理后的血浆悬液吸出0.1ml置于小试管中(lcm×7.5cm),同时各吸取标准内毒素(1μg/L)和灭菌蒸馏水各0.1ml作为阳性和阴性对照,各加鲎试剂0.1ml,轻轻摇匀后放在37℃水浴箱中,30min1h时各观察一次。观察时轻轻将试管取出,倾斜成45°,肉眼判断凝胶形成硬度。

鲎试验的测定操作简述(一)

2、微置玻片呈色法

鲎试剂与内毒素作用形成凝胶后,用溴酚蓝染色,再压上盖玻片,形成呈色的“片状物”即为阳性。阳性反应呈“片状物”是由于高黏度颗粒的表面黏度系数增加所致;阴性则形成蓝色“环状圈”是由于反应产物的黏度低于阳性反应物,它的边缘是一种低黏度的溶液,由于粒度系数的降低而形成环状。

方法:取上述除去干扰物后的血浆悬液78μl及内毒素(1μg/L)和灭菌蒸馏水各7~8μl,分别置于玻片上形成圆滴状;之后,各加等量鲎试剂,混匀,使仍保持圆滴状,不能有气泡;将混合物置湿盒中,置37℃水浴箱内孵育30min;取出后各加1滴溴酚蓝染色液,轻轻将盖玻片置于混合液上,2~3min后观察结果。

结果判断如下:如见有分布均匀的细胞碎片并有较明显的直径在4~5mm的蓝色圆环,或在显微镜(低倍)下见有细胞碎片颗粒均匀分布即为阴性;如呈蓝色散在凝胶为弱阳性(±);见有蓝色小片凝胶则为阳性(﹢);见有大片蓝色片状凝胶形成则为强阳性(﹢﹢)。

3、两种内毒素检测方法的比较

110例健康人内毒素检测的结果见表37-1

210份不同患者的血浆标本用两种方法检测的结果见表37-2

结果分析:在10例健康人内毒素检测中,两种方法比较均为阴性。在血浆干扰物处理方面,以加热法为好,其敏感性亦较高;认为玻片法尚好,试剂量少而简便。

10例健康人内毒素检测结果

4、动态浊度法

动态浊度法的原理:动态浊度法是根据鲎试剂与细菌内毒素发生凝集反应,在凝集的过程中,反应物的浊度会随着反应的进行逐渐增加。经过大量研究发现,凝集反应的快慢与细菌内毒素的含量有关,细菌内毒素的含量越高,反应速度就越快。作者把检测到的反应时间同细菌内毒素含量进行对数计算,可以得到一直线,对于同一批鲎试剂,实验测得的直线方程基本相同,发现它们符合直线方程并作为该批鲎试剂的标准曲线,用该鲎试剂测定供试品的细菌内毒素时,测得实际值,通过标准曲线上就可以计算出细菌内毒素含量。

5、荧光偏光法

荧光偏光法原理:本方法的原理是应用荧光分子的微小黏度环境变化参数,即使荧光物荧光胺与变形细胞溶解物(鲎试剂)结合,当有内毒素掺入时,则蛋白凝胶发生结构上的变化。蛋白结合的荧光胺由于水分子运转而与蛋白分离,此时荧光分子被固定时所表示出的荧光偏光强度,也就是蛋白结合荧光(它有一定的偏光强度),在凝胶形成的一瞬间发生荧光偏光的变化,这种蛋白结合的荧光胺和其解离后二者偏光强度的变化即为荧光偏光度(P),可用以下公式计算:

 

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