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基质显色法的测定操作介绍

基质显色法的测定操作介绍

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  • 发布时间:2023-10-23 16:38
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【概要描述】基质显色法与凝胶法一样,均是利用鲎血变形细胞裂解物中含有可被微量内毒素激活的凝固系统设计而成。该凝固系统包括B因子、C因子、凝固酶原、Ca2+和凝固蛋白原,微量内毒素即可依次激活凝固系统各因子,被激活的凝固酶原具有酰胺酶专一活性,可特异性水解人工合成三肽显色基质N-叔丁氧碳酰-L-亮氨酸-甘氨酸-L-精氨酰-对硝基苯胺(Boc-Leu-Gly-Arg-PNA)中所含的游离肽链,使被内毒素水解后的精氨酰-对硝基苯胺偶氮化形成偶氯蓝复合物(玫瑰红色),后者在545nm波长处有最大吸收峰,可进行定量检测。

基质显色法的测定操作介绍

【概要描述】基质显色法与凝胶法一样,均是利用鲎血变形细胞裂解物中含有可被微量内毒素激活的凝固系统设计而成。该凝固系统包括B因子、C因子、凝固酶原、Ca2+和凝固蛋白原,微量内毒素即可依次激活凝固系统各因子,被激活的凝固酶原具有酰胺酶专一活性,可特异性水解人工合成三肽显色基质N-叔丁氧碳酰-L-亮氨酸-甘氨酸-L-精氨酰-对硝基苯胺(Boc-Leu-Gly-Arg-PNA)中所含的游离肽链,使被内毒素水解后的精氨酰-对硝基苯胺偶氮化形成偶氯蓝复合物(玫瑰红色),后者在545nm波长处有最大吸收峰,可进行定量检测。

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基质显色法与凝胶法一样,均是利用鲎血变形细胞裂解物中含有可被微量内毒素激活的凝固系统设计而成。该凝固系统包括B因子、C因子、凝固酶原、Ca2+和凝固蛋白原,微量内毒素即可依次激活凝固系统各因子,被激活的凝固酶原具有酰胺酶专一活性,可特异性水解人工合成三肽显色基质N-叔丁氧碳酰-L-亮氨酸-甘氨酸-L-精氨酰-对硝基苯胺(Boc-Leu-Gly-Arg-PNA)中所含的游离肽链,使被内毒素水解后的精氨酰-对硝基苯胺偶氮化形成偶氯蓝复合物(玫瑰红色),后者在545nm波长处有最大吸收峰,可进行定量检测。

1)测定试剂盒内容:

鲎试剂0.7ml(专供试剂盒用);0.4mol/LTris-HC1·Mg2+缓冲液(pH8.01ml0.04mol/L的鲎三肽(Boc-Leu-Gly-Arg-PNA)溶液0.5ml0.48mol/L的盐酸溶液6.2ml0.5%的亚硝酸钠溶液6.2ml0.05%的氨基磺酸铵溶液6.2ml0.05%的萘乙二胺溶液6.2ml;无热原水(含NaCl);细菌内毒素。

2)试剂配制:

鲎试剂按标量加入0.4mol/LTris-HC1·Mg2+缓冲液,轻轻混匀;亚硝酸钠加入0.48mol/L的盐酸溶液6.2ml,混匀;氨基磺酸铵加入蒸馏水6.2ml,混匀;萘乙二胺加入蒸馏水6.2ml,混匀。

上述配制的试剂与鲎三肽均应一次用毕,不宜保存。

(3)器材与处理:

①器材:10mm×75mm试管;0.5ml1ml2ml刻度吸管﹔50μl100μl500μl定量移液器。②器材去热原处理:用于本检测的器材在终止反应前,凡与鲎试剂接触的物件均需去热原。玻璃器材清洗干净后要经250℃干热2h后方可使用;塑料制品清洗干净后在30%过氧化氢中浸泡4h,用无热原水冲洗后在60℃中烘干使用。

(4)检测方法:

①检测步骤(表37-3):吸取样品0.1ml与鲎试剂0.05ml轻轻混匀,置于37℃水浴25min;再加入鲎三肽0.05ml,置于37℃水浴3min;取出后加入亚硝酸钠溶液0.5ml,混匀后加入氨基磺酸铵溶液0.5ml混匀,再加入萘乙二胺溶液0.5ml混匀,之后于波长545nm比色读数。②制定内毒素标准曲线:将内毒素稀释到1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/m10.0625EU/ml0.03125EU/ml,然后按前述检测法测得上面各种浓度内毒素的A值,定出标准曲线。A值的计算公式为:A=As-Ab-Abb)。按这一公式求得吸光度A值后,再查对内毒素标准曲线,求得内毒素含量。如果A值超出曲线范围,可将试样稀释后再测定。

基质显色法的测定操作介绍

(5)注意事项:

①上述操作应在终止反映前将试管置于冰-水浴中进行。②试验标本应保存在4℃以下,且应在48h内完成。③采取血标本均需无菌、无热原操作,肝素(抗凝剂)去热原需用120℃间隙干烤48~56h后使用。④临床检测标本中若含有抑制试验因子者要进行去抑制因子的预处理,如血浆、腹水,一般可用加热法。例如血标本,采取人体静脉血1ml置于无热原肝素中,500r/min离心5min,取血浆0.1ml,加入无热原生理盐水0.2mlTris-HCl缓冲液0.2ml混匀,置于100℃水浴加热10min3000r/min离心10min,去上清液检测。

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